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** Vydac 259VHP polymer column Care **

작성자 : 충인과학

Date : 2015-07-28 16:59 | Hit : 1,535

< Vydac 259VHP Polymer Reversed-Phase Columns >

Vydac 259VHP Polymer Reversed-Phase Columns은 300Å pore의 highly cross-linked polystylene-divinylbenzene copolymer beads를 포함하고 있다.
proprietary surface modification이 분리능을 강화한다. 259VHP는 protein/peptide 분리를 위하여 고안되었지만, 저분자의 분리에도 사용된다. 1N acid부터 1N base까지 상온에서 안정하다. 이 컬럼은 silica-based Reversed-Phase Column에서는 불가능한 넓은 pH 범위를 지닌다. 259VHP는 대부분의 유기 용매와 융화가 가능하다.

* Shipping and first use *

   259VHP column은 50:50 ACN:Water로 shipping된다. 사용하기 전에 우리는 10배의
   column volume으로(259VHP5415의 경우 25mL) weak mobile phase(solvent A)로
   rinse해 주고, 0∼100% B로 blank gradient를 걸어줄 것을 권장한다.

* Pressure Limit *

   259VHP column은 3000psi(200bar)까지 안정하다. 수명을 늘이기 위해서는
   259VHP5415의 경우(4.6 x 150mm) flow rate를 1.0mL/min 이하로 해주어야 한다.
   다른 크기의 컬럼에 대해서는 적절히 조정해 준다.

* Chemical and Temperature Stability *

   259VHP는 pH0∼14, temp.0∼80℃까지 안정하다. 그러나 강산과 강염기의 cleaning은
   고온에서 하면 안된다.

* Column Cleaning and Regeneration *

컬럼이 오염되었을 경우, 259VHP 컬럼은 일반적인 denaturants의 spot injection으로 cleaning한다. 모든 denaturant solution은 0.5um보다 큰 입자를 제거하기 위해 사용되기 직전에 membrane filter를 해주어야 한다. 작은 부피의 경우 syringe filter가 편리하다.
강염기의 경우(1N NaOH), polyimide injector rotor가 base-resistant mator로 교체하고, 입자 제거를 위해 membrane filter를 사용한다. 모든 과정은 별도 언급이 없는한 실온에서 진행되어야 한다. 컬럼을 흐름의 역방향으로 연결한다. HPLC system은 0∼100% B를 1.0mL/min(4.6mmID) flow rate로 A와 10 분간 gradient로 흘려준다.
(A: 0.1% TFA (v/v) in 10:90, ACN : Water
B: 0.1% TFA (v/v) in 90:10, ACN : Water)
280nm에서 absorbence를 지속적으로 측정한다. 각각의 과정에 대해, solvent A에 denaturant를 주입하고, gradient 한다. baseline이 잡힐 때 가지 이 과정을 반복한다.

◆ contaminant에 따라 아래의 denaturant가 효과적이다. (injection vol.은 4.6mmID 기준)

1)  1% or 2% SDS in 10:90 ACN:Water.  Inject 500uL

2)  50:50,  IPA:6M guanidine HCl.   Inject 200uL at 0.2mL/min
    (이 용액은 매우 점성이 강하므로 low flow rate로 해야한다.
     또한 입자가 생겨 컬럼이 막히는 것을 방지하기 위해, IPA추가 전후에
     guanidine HCl 용액을 두세번 가량 filter해 주는 것이 중요하다.)

3)  Any of the following at low flow (0.2mL/min)
  ㆍ 100% TFA. inject 200uL
  ㆍ Glacial acetic acid. inject 1mL
  ㆍ Formic acid. inject 1mL
  ㆍ 1M phosphoric acid. inject 1mL
step2를 반복한다. step1 through step3 are strongly solubilizing for proteins and lipids.

4) 1N NaOH. inject 2∼3mL at 0.2mL/min
   ( Base hydrolysis of protein and peptides breaks them into smaller units with
     greater solubility. )

280nm에서 컬럼이 깨끗함을 나타내면, normal gradient condition에서 컬럼 수행을 테스트한다. 다른 방법들이 있다면,

◆ normal mobile phase buffer를 사용하면서, 컬럼 온도는 60℃까지 높여주고, 0∼100%
   ACN gradient를 몇 번 흘려준다.

◆ step1∼4를 mobile phase에 ACN대신에 IPA 사용하면서 반복한다. 이 mobile phase의
   더 높은 점성을 고려하여 0.5mL/min 가량의 낮은 flow rate를 사용한다.

◆ 만일 이러한 step들이 모든 lipid나 비극성 오염물을 제거하지 못한다면, Chloroform이나  Dichloromethane으로 rinse하여 cleaning할 수 있다.
   silica based protein/peptide 역상 컬럼이므로, water로 부터의 과정에 중간적인 과정
   으로서 IPA나 Acetone과 같은 상호 잘 섞이는 intermediate로 rinse해 주어야 한다.