1. 컬럼 선택시 주의사항

2. 컬럼 사용시 주의사항

3. 용매 사용시 주의사항

4. 샘플 사용시 주의사항

5. Column conditioning

6. 압력과 온도의 조절

7. 성능 테스트

8. 화학적 안정성

9. 추천 Elution 조건

10. 세척제 및 다른 화학제품

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3. 용매 사용시 주의사항

1. HPLC 분석에는 불순물이 제거된 HPLC 등급의 용매를 사용해야한다. 

용매의 불순물들은 크로마토그래피 결과에 나쁜 영향을 주기 때문에 간혹  컬럼을 다시 사용할 수 없게 오염시킬수도 있다.

2. 용매 선택시 주의사항

⑴ 컬럼에 적합한 이동상 용매를 사용해야한다.

silica컬럼 의 경우 pH2.0-7.5 사이의 buffer를 일반적으로 사용한다.

Genesis column과 같은 새로운 silica material은 일반적인 범위를 넘어선 조건에서도 사용 가능하며, C18의 경우 pH1-10의 범위까지 안정하다. 온도, buffer종류, 농도, 유기 함량 같은 조건들이 pH 안정화 범위에 영향을 미칠수 있음을 명심해야한다.

⑵ 만약 이 범위를 벗어난 조건에서 분석을 수행해야 한다면, 극한의 pH에서도 안정한 특수한 material의 사용을 고려해 볼 필요성이 있다. 분석용 컬럼으로 같은 phase를 가지는 pre-saturation된 컬럼도 역시 사용가능하다. 펌프와 injector 사이에 위치된 pre-saturation 된 컬럼은 silica를 녹이는 이동상으로 포화시켜 용매 분해로부터 분석용 컬럼을 보호한다.

3. 이동상 용매는 사용하기 전에 0.2um 또는 0.5um의 membrane 필터를 사용하여 반드시 걸러 주어야 한다.

수용성 완충액의 경우 미생물이 자라는 것을 방지하기 위해서 매일 새로 준비하거나 사용하기 전에 필터링 해야 한다.

주입장치와 컬럼 사이에 있는 0.5um의 인라인 필터는 남아있는 입자들을 걸러준다. 컬럼의 프릿(fritz) 또한 filtering 함으로서 이나 충진물이 입자화 되는 것을 방지한다. 이러한 입자들이 누적될 경우 컬럼의 back-pressure가 증가시킨다.

4.이동상을 완충 용액에서 유기 농도를 높일 때, salt의 침전을 피하기 위해서 용매를 바꾸기 전 완충물질이 없는 수용성 용매를 사용하여 충분히 세척한다. 완충제의 침전은 컬럼을 파괴하고 HPLC 시스템에 손상을 줄 수 있다.

5. 테트라-부틸-염화 암모늄과 옥탄술포닉산과 같은 ion-paring 시약은 역상의 정지상(컬럼)에 지속적으로 흡수되는 경향을 보이기 때문에, 컬럼의 크로마토그래피의 패턴을 바꾸게 된다. 따라서 이러한 시약을 한번 사용하게 되면, 그 컬럼은 ion-paring 분리에만 사용하도록 표시할 것을 권장한다.

4. 샘플 사용시 주의사항

1. 시료는 주입하기 전 0.2um 또는 0.5um의 syring filer나 membrane filter로 걸러줘야 한다. 생물학적 시료를 사용할 때 방해 물질들을 "침전법, 거름장치, 원심분리, 고체상추출법 (SPE)"와 같은 기술을 사용하여 제거한다. SPE를 사용하여 준비한 시료는 컬럼의 수명을 연장시키고, 더 좋은 크로마토그래피 결과와 분석 감도를 향상시킨다.

         * HPLC에서는 샘플과 solvent등의 전처리과정이 가장 중요하다!

2. Main column과 주입장치 사이에 Guard column을 설치하여 입자들을 제거하고, 컬럼을 salt로부터 보호하여 컬럼의 수명을 연장시키고 불순물의 피크를 제거한다.

3. 시료는 반드시 이동상과 혼합될 수 있는 용매에 녹여 사용해야 하며, 일반적으로 이동상 보다 더 약한 용매를 사용하는 것이 좋다.

5. Column conditioning

1. 역상의 특성으로 인해, 폴리펩타이드와 같은 소량의 물질을 최초 주입 하는 동안 컬럼의특성(resoultion, retention 등)이 조금 바뀔수 있다. 이것은 "column conditioning"이라고 부르며 10,000 이상의 분자량을 가지는 대부분의 폴리펩타이드의 경우 발생된다.

컬럼의 성능이 일정해 질 때까지 폴리펩타이드들을 반복적으로 주입함으로써 column conditioning을 수행할 수 있다.

2. 일반적으로 4.6x250mm의 컬럼에 대해서는 100ug의 폴리펩타이드를 주입한다. 다른 방식으로는 리보핵산 분해효소와 같이 쉽게 이용할 수 있는 단백질을 주입하고 0.1%의 TFA를 포함한 Acetonitrile을 Gradient로 용출함으로 컬럼 조절을 수행한다.