III. Properties of HPLC columns [ HPLC 컬럼의 특성 ]

1. 분리방법의 종류

        ⑴ Normal-phase Chromatography

        ⑵ Reversed-phase Chromatography

        ⑶ Ion-Exchange Chromatography

        ⑷ Affinity Chromatography

2. 컬럼제작의 원료

3. Particle 특성

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1. 분리방법의 종류

(1) Normal-phase Chromatography (NP)

순상 크로마토그래피 = Normal-phase Chromatography는 극성 분석샘플과 비극성 이동상(Solvent)을 이용하는 고전적인 형태의 액체 크로마토그래피이다.

분석물에 붙어있는 극성 그룹과 충진제에 붙어있는 극성 그룹과의 상호작용으로 인해 각 혼합물의 흘러가는 속도의 차이가 발생한다. 분석물은 가장 덜 극성을 띄는 화합물들이 컬럼에서 가장 먼저 용출되고, 이어서 극성이 증가되는 순서로 화합물들이 용출된다.

NP는 낮거나 중간적인 극성을 가지는 분석물과 낮은 극성 용매에서 수용성이 높은 화합물의 분리에 유용하다.

단, 물에 잘 녹는 분석물일 경우 일반적으로 순상 크로마토그래피를 이용하여 분석하는 것을 권장하지 않는다.

(2) Reversed-phase Chromatography (RP)

역상 크로마토그래피 = Reversed-phase Chromatography는 가장 일반적인 분리방법이다.

정지상은 비극성이고 이동상은 극성이다.

분석물질의 비극성 그룹과 컬럼의 표면의 비극성 그룹과의 상호작용에 의해 분리되며 가장 극성인 분석물이 먼저 용출되고 극성이 낮은 순서로 분석물이 용출된다.

역상 크로마토그래피는 극성이 높거나 중간정도인 화합물의 분리에 유용하다.

(3) Ion-Exchange Chromatography (IC)

이온교환 크로마토그래피 = Ion-Exchange Chromatography는 분석물들의 이온그룹의 차이로 분리한다.

이온 교환에서의 정지상은 일반적으로 polymeric media에 전체적으로 분포되어 있는 이온 기능 그룹으로 이루어져 있다.

약이온 교환상은 일반적으로 pH에 영향을 받는다.

그러나 강이온 교환상은 항상 전하가 충전되있기 때문에 pH 변화에 큰영향을 안받는다.

(4) Affinity chromatography

Affinity chromatography는 분석물과 컬럼사이에 열쇠-자물쇠 개념(Antibody-Antigene)을 가지고 있다.

분석 혼합물안의 여러가지 물질 중에서, 특정한 물질에만 상호작용을 하는 반응기가 컬럼에 존재하여 특이적으로 반응을 한다. Affinity chromatography는 현재 가장 강력한 형태의 크로마토그래피이다.

2. 컬럼제작의 원료

(1) Silica

투과성을 가지는 실리카 입자는 HPLC 컬럼 충진에 사용되는 가장 일반적인 물질이다.

실리카 기반의 컬럼은 고압에 강하며, 대부분의 유기, 수용성 이동상에서 사용가능하며 결합상의 범위가 매우 넓다.

실리카 컬럼은 pH가 2-7.5 범위의 이동상과 샘플을 사용하여 낮은 분자량의 분석물의 분석에 종종 사용된다.

EVEREST, DENALI, GENESIS, Kromasil과 같은 새로운 실리카 물질은 더욱 넓은 범위의 pH 범위를 가진다.

(2) Polymeric

강하게 Cross-linke된 styrene-divinylbenzene 기반의 충진재들은 1-14의 pH 범위를 가지는 대부분의 이동상과 샘플 분석에 사용가능하다.

Polymer-base(중합체 기반)으로 이루어진 컬럼은 작은 분자들의 분리에서 실리카 컬럼에 비해 낮은 효율을 보이는데, 이는 중합체 컬럼이 상대적으로 더 작은 표면적을 가지기 때문이다.

또한 중합체 기반 컬럼은 기계적인 강도도 낮기 때문에 높은 압력에 견디지 못한다.

그러나 실리카 기반의 컬럼의 일반적인 pH범위를 벗어나는 이동상을 필요로 하는 샘플의 경우 하나의 좋은 선택이 될수 있다.

중합 충진제는 종종 이온 교환 분리에 이용되며, 비수용성 GPC size-excluing분석과 Organic acid(유기산)이나 Carbohydrate의 ion-exclusion 분석에서도 역시 효과적이다.