III. Properties of HPLC columns [ HPLC 컬럼의 특성 ]

1. 분리방법의 종류

        ⑴ Normal-phase Chromatography

        ⑵ Reversed-phase Chromatography

        ⑶ Ion-Exchange Chromatography

        ⑷ Affinity Chromatography

2. 컬럼제작의 원료

3. Particle 특성

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3. Particle 특성

(1) Irreugular shape : 부정형 입자

최초로 사용된 HPLC 컬럼은 불규칙적인 모양을 가진 실리카 입자를 이용하였다.

이러한 이유로 여전히 많은 분석 방법에서 불규칙적인 충진입자 컬럼을 사용하고 있다.

불규칙적인 입자는 높은 표면적, 수용성, 저럼한 비용으로 인해 대량의 prep column등의 분야에도 사용되고 있다.

(2) Spherical shape : 구형 입자

새로운 HPLC 컬럼은 주로 타원형 또는 구형입자로 충진된다.

구형 입자는 불규칙적인 모양을 가진 입자에 비해 효율성과 컬럼 안정성이 좋으며 역압이 낮다.

(3) Particle size

Particle size란 HPLC 컬럼 충진제의 입자들의 평균 직경을 나타낸다.

입자의 크기는 컬럼의 역압과 분리 효율성에 영향을 준다.

컬럼의 역압과 효율성은 입자 직경의 제곱에 반비례하는 경향을 보인다.

이것은 입자의 크기가 작아질수록 컬럼의 역압이나 효율성이 증가함을 의미한다.

3um의 직경을 가지는 충진제로 매우 잘 충진된 컬럼은 5um 컬럼에 비해 거의 2배가 되는 효율성을 보인다.

그러나 동일한 조건의 이동상과 유속에서 3um의 컬럼은 3배 더 높은 역압을 보인다.

높은 효율을 가지며 작은 입자 (3, 4um)를 가지는 컬럼은 작은 구성요소로 이루어진 복잡한 혼합물 분리에 좋다.

또한 짧은 컬럼(길이 10-50mm)에서 작은 입자로 충진된 컬럼을 사용할 경우 뛰어난 성능의 분리가 가능하다.

Grace Vydac은 특별히 이러한 빠른 HPLC용으로 ShortFast와 Lighting HPLC 컬럼을 공급하고 있다.

* 5um와 7um컬럼은 분석하고자 하는 물질이 구조적으로 매우 다른 차이점을 가지는 일반적인 분석법에 사용된다.

* 10um 충진제는 컬럼 효율아 조금 낮으나 10um 충진제로 충진된 컬럼은 이후 prep 분리나 semi-prep 분리를

  위한 테스트 컬럼, 또는 고효율이 필요치 않은 일반적인 QA/QC 방법에 일반적으로 사용되고 있다.

* 15-20um의 입자는 prep-process scale의 분리에 사용된다.

(4) Pore size

충진 물질의 Pore size는 각각 입자들 사이의 평균 공극을 나타낸다.

적합한 공극 크기를 선택할 때는 분석하고자 하는 시료의 크기를 신중히 고려해야만 한다

분석물의 분자량을 분자의 크기를 계산하는데 사용할 수 있다.

일반적인 규칙으로는

: 3,000MW 이하의 시료 분석에는100Å이나 이하를 사용한다.

: 샘플의 크기가 3,000-10,000MW 범위인 것들을 100-130Å을 사용하기를 권장한다.

: 펩타이드나 단백질과 같이 10,000MW 보다 큰 크기의 샘플의 경우 300Å의 물질을 사용하는 것이 가장 효과적이다.

(5) Pore volume

Pore volume (=공극 부피)는 컬럼내 입자들 사이의 빈 공간을 나타낸다.

공극 부피는 충진제의 기계적 강도를 나타내는 좋은 표지이다.

: 넓은 공극 부피를 가지는 입자들은 일반적으로 작은 공극 부피를 가지는 입자들에 비해 약하다.

: 공극의 부피가 1.0mL/g 또는 이보다 적은 것들이 대부분의 HPLC 분리에 권장된다.

: 공극 부피가 이보다 큰 것들은 size-exclusion chromatogrpahy나, 낮은 압력을 요구하는 방법에 유용하다.

(6) Surface Area (표면적)

Particle의 물리적인 구조는 packing material의 표면적을 결정하며, 표면적은 pore size에 의해 결정된다.

Pore size와 surface area는 반비례관계이며,

충진제의 pore size가 작을수록 표면적은 넓어지고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.

: 높은 표면적을 가지는 물질은 더 큰 수용력을 가지고 분석 지연 시간도 더 길다.

: 낮은 표면적을 가지는 충진제는 빠른 평형 시간을 가지며 분자량이 큰 물질의 분리에 사용된다.

(7) Carbon Load

Carbon load는 충진제의 표면에 결합한 결합상의 수를 측정한 것이다.

: 높은 carbon load는 컬럼의 수용력을 높이고 해상도를 향상시킨다.

: 낮은 carbon load는 지연성이 적은 충진제를 만들고 분석시간을 빠르게 한다.

(8) Surface Coverage

Surface Coverage는 충진 물질의 carbon load와 surface area로 계산된다.

Surface Coverage는 retention, selectivity, 결합상의 안정성에 영향을 준다.

(9) End-capping

End-cap된 역상 column은 silica surface에서 silanol 영향으로 생기는 예상치 못한 이차 상호작용을 제거하기 때문에 bonding 작업이 필요하지 않다.

염기성 분석물은 엔드 캡핑 되지 않은 컬럼에서 비대칭적이고 tailing을 발생시키는 피크를 만들게 되어,

이동상에 modifier를 첨가해야 한다.

그러나 End-cap 하지 않은 물질은 end-cap된 컬럼에 비해 다른 선택성을 보인다.

이러한 선택성의 차이는 이차 silanol 반응을 조절함으로써 극성 물질의 분리능을 더욱 향상시킬수도 있다.

(10) 컬럼 길이, 내경, 부피

컬럼의 packing material을 선택했다면, HPLC column의 물리적인 요소들을 최상의 분리를 위해 조정한다.

특히 컬럼의 길이, 내경, 부피의 관계를 이해하는것은 매우 중요하다.

컬럼의 길이 (L)과 내부 직경 (d)를 이용하여

다음 식에 의해 HPLC 컬럼의 내부 부피 (V)를 결정한다:

하지만 이 식으로 충진 물질에 의한 액체 부피가 감소되는 것은 설명하지 못한다.

이것은 컬럼 부피에서의 최대한계이며, 컬럼에서 retain되지 않는 분석물을 용출하는데 필요한 최소부피이기도 하다.

같은 질량의 시료를 주입했을 경우 작은 직경을 가지는 컬럼은 큰 직경을 가지는 컬럼에 비해 높은 선택성을 보이게 되는데 이는 이동상에서의 시료의 농축이 더 많이 되기 때문이다.

작은 직경을 가지는 컬럼은 컬럼 전체에 일정한 속도를 유지하기 위해서 더 낮은 유속이 필요하기 때문에 더 적은 양의 이동상을 사용하게 된다.

더 넓은 내부직경을 가지는 컬럼은 샘플 로딩량을 높여주고 역압을 감소시킨다. 주어진 유속에서의 컬럼의 역압은 컬럼의 길이가 증가할수록, 컬럼 내부직경이 작을수록 증가한다.

(11) Flow rate

분리의 최적화를 위해서 또는 Pre이나 Narrow-bore에 적용하기 위해 컬럼의 scale을 바꾸어야 하는 경우, 이동상의 유속은 지속적인 속도와 지연 시간을 유지하기 위해서는 이동상의 유속을 컬럼의 교차 분할된 면적에 비율적으로 맞게 조절해야만 한다.

다음에 나타낸 식은 다른 내부직경 (d)을 가지는 컬럼의 유속 (F)을 조절하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.