V. HPLC Troubleshoot [ HPLC 사용시 문제해결방법 ]

0. 서론

1. Leak

2. 압력문제

3. Retention-time 문제 #5-8

4. Baseline noise

5. Baseline Drift

6. Peak Problem

7. Sensivity Problem

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4. BaselineNoise

베이스라인 문제는 모양의 변화로 나타난다. 이 변화는 샘플이 주입되지 않을 때 조차도 나타날 수 있다.

베이스라인 노이즈는 HPLC 장비, 외부적인 요인, 또는 분리과정 자체의 문제들로부터 야기될수 있다. 이러한 문제들의 원인을 찾는 것은 이 세가지 요인을 포함하는 것들로부터 시작해야한다.

제일 먼저 유속을 0으로 설정하고 문제점이 사라지는지를 관찰하는 것이다. 만일 문제점이 그로마토그래피 과정에 연관되어 있다면, 베이스라인은 곧게 될 것이다. 이러한 문제점들이 장비나 환경적 요인때문이라면 노이즈는 계속 나타나게 된다.

(1) 불규칙한 Baseline Noise

만약 베이스라인 노이즈가 랜덤하거나, 튀거나, 용매 흐름을 정지했을 때 없어진다면, 디텍터 장치에 공기방울이 있거나 컬럼이 오염되었기 때문일 것이다.

디텍터내에 있는 공기방울은 역압 조절 장치를 이용하여 종종 제거된다. 디텍터의 외부 연결에 나타나는 매우 작은 압력은, 이동상이 디텍터를 세척 할 때까지 용액에 공기방울이 남아 있게 한다.

작은 직경을 가지는 디텍터의 외부 연결 튜빙의 짧은 코일로 이런 문제를 해결할 수 있다.

유속을 높이는 것 역시 압력을 높이고 공기방울들을 용매로 녹아들게 함으로써 디텍터 내에 있는 공기방울들을 제거하는데 도움을 준다. 이렇게 하는 경우, 압력이 허용 한계를 넘지 않도록 주의해야한다.

완벽하게 기체를 제거한 이동상 용매는 공기 방울 형성의 방지에 도움이 된다.

(2) 반복되는 Baseline noise

반복되는 베이스라인 노이즈는 용매를 섞어주는 gradient system에서 이동상의 조성을 변화시킴으로 나타나게 된다.

이것은 한 용매의 비율이 설정된 것보다 5% 정도 낮게 되었을 때 자주 발생된다.

이때 베이스라인 노이즈의 주기를 살펴서 high pressure-mixing system의 낮은 유속펌프의 피스톤 회전 주기와 일치하는지, 또는 low pressure-mixing system에서의 낮은 퍼센트의 용매의 섞어주는 벨브의 회전과 일치하는지를 관찰해야 한다.

만일 노이즈가 용매를 섞어주는 것 때문에 발생된 것이라면, 분리를 위해 미리 섞어 놓은 이동상을 사용하거나 이동상 성분을 조절하여 Gradient mixing 비율이 5% 보다 적게 프로그램을 설정하는 것으로 해결할 수 있다.

이러한 노이즈를 제거하기 위한 또 다른 방법은, 관찰되는 파장 영역에서 투과성이 높은 용매로 이동상을 만들어 사용하는 것과 이동상의 조성에서 낮은 정도의 변화를 없앨 수 있는 대용량의 믹싱 장치를 이용하는 것 등이 있다.

(3) 물결모양의 Baseline noise

물결모양의 베이스라인은 오염되거나 가드 컬럼이나 분석 컬럼에서 늦게 용출되는 성분들 때문에 생성된다.

이러한 현상 역시 이동상 자체의 오염으로 인해나타날 수 있다.

강한 용매로 이러한 오염물질을 제거하기 위해 세척하거나 항상 HPLC 등급의 물과 용매를 사용하여 이동상을 만들어 사용해야 한다.

(4) 유속이 없을때의 Baseline noise

유속을 정지한 상태에서도 베이스라인 노이즈가 계속된다면, 문제점은 디텍터의 램프나 환경적 문제에 연관되어 있을 것이다.

빠른 노이즈 스파이크는 디텍터 램프를 교체할 필요가 있다는 신호이다.

대부분의 UV 램프는 1,000 시간의 사용 수명을 가지고, 이 기간이 넘게 되면 교체해야만 한다.

(5) 외부영향으로 인한 Baseline noise

외부 환경의 요인으로 인해 베이스라인 노이즈가 생길 수 있다.

노이즈가 규칙적인 간격으로 나타나면 같은 전기회로에 있는 다른 장치와 설비들의 연결을 끊거나 다른 이용 가능한 회로에 다시 연결한다. 또한 HPLC 시스템의 모든 구성요소들이 공통으로 연결되어있는 것이 원인이 될 수 있다.