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separation conditions & care for Kromasil column

작성자 : 충인과학

Date : 2015-07-28 11:31 | Hit : 1,297

< Optimal flow rate >

최적 flow rate는 다음과 같은 조건에 달려있다.

* particle size :   small molecule 분석시  4.6 mm ID 컬럼에서,
                         5 μm 은 1 ml/min flow rate가 적합하고,  10 μm는 0.5 ml/min 가 적합하다.
                         이것은  HPLC textbook에 나오는  Knox 식으로 계산된 것이다.

*  molecular weight :  분자가 작을수록 flow rate를 높게 해주는 것이 효과적이다.
                        이는 분자가 작아질수록 확산 능력이 커지기 때문이다. 따라서 큰 분자에서는
                        확산 정도가 낮으므로 flow rate를 감소시켜야한다. (큰 분자는 매우 천천히 움직인다.)

*  Column diameter.: 이는 flow rate와 매우 직접적인 관련이 있다.
                          Scale up할 경우 flow rate는 scale up factor에 의존하여 증가한다.
                          Scale up factor = (큰컬럼의 직경/작은 컬럼의 직경) 으로 계산된다.
            가령 4.6mm ID 에서 20mm ID로 scale up할 경우, scale up factor = (20/4.6)의 제곱=18.9 이다.
            다시말하면, 4.6에서 1ml/min flow였다면, 20에서는 18.9ml/min으로  흘려주면 된다.


< loading capacity  >

이것은 separation factor, 다시말하면 목표물질과 impurities사이의 space에 달려있다. 경우에 따라 매우
다른 loading capacity를 지니지만, 일반적으로 1-30mg/g이 컬럼에 load될 수 있다,
column volume은 매우 간단히 계산된다. (가령 4.6 x 250 = 4.15 ml)
또한 material의 packing density를 이용하여 packing material 의 양을 계산할 수 있다. 가령 C8의 density는 0.60g/ml이다. 따라서 C8의 packing material 의 양은 2.49g silica이다.
크기가 더 큰 컬럼에 대해서는 마찬가지로 scaling factor를 사용하여 같은 방법으로 계산하면 된다.

< Washing of an RP column >

우선은  solvent 농도를 증가시켜가면서 세척해준다. 이것이 소용없다면 MeCl2 나 THF 와 같은 stronger eluting solvents를 사용한다. 최후의 방법은0.1 M NaOH 과 60% organic로column volumes의 5-10배 가량으로 regeneration시킨 다음, 0.2 M Ha로 중성화 시킨 후 mobile phase를 사용한다.

< Regeneration of bare silica (normal phase) >

bare silica 의 regeneration은 시간이 오래걸린다. equilibration 시간이 오래걸리기 때문인데, 다음 solvent들을 사용해보길 권한다.

- NH3 (0.5% - 1.5%)
- HNO3 (1/200 = conc. HNO3/water)
- Water
- Alcohol (e.g. MeOH or EtOH)
- THF or EtAc
- Mobile phase

우선 리스트에서"mobile phase" 위에 있는 solvent들(THF or EtAc)을 사용한다. 이것이 소용이 없다면 다음으로 alcohol과 그밖의 것들을 사용해 본다. 궁극적인 최후의 방법은 NH3로 시작해는 것이다
이렇게 하면 상기의 모든 solvent를 이용해본 셈이 되는데, 최후에는 mobile phase를 사용한다.